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Titelaufnahme

Titel
Periodically suspended membranes as a versatile platform for studying translocation by high-speed AFM / submitted by Andreas Karner
VerfasserKarner, Andreas
Begutachter / BegutachterinHinterdorfer, Peter ; Pohl, Peter
ErschienenLinz, 2016
UmfangXI, 80 Seiten : Illustrationen
HochschulschriftUniversität Linz, Univ., Dissertation, 2016
Anmerkung
Zusammenfassung in deutscher Sprache
SpracheEnglisch
Bibl. ReferenzOeBB
DokumenttypDissertation
Schlagwörter (DE)Hochgeschwindigkeits-Rasterkraftmikroskopie / Membranproteine / Translokation / Lipidmembran / Mobilität
Schlagwörter (EN)high-speed atomic force microscopy / membrane proteins / translocation / lipid membrane / mobility
Schlagwörter (GND)Membranproteine / Translokation / Lipidmembran / Mobilität / High speed atomic force microscopy
URNurn:nbn:at:at-ubl:1-12564 Persistent Identifier (URN)
Zugriffsbeschränkung
 Das Werk ist gemäß den "Hinweisen für BenützerInnen" verfügbar
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Periodically suspended membranes as a versatile platform for studying translocation by high-speed AFM [17.83 mb]
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Klassifikation
Zusammenfassung (Deutsch)

Lipidmembranen stellen die physischen Grenzen von biologischen Zellen dar. Darin integrierte Membranproteine agieren als funktionelle Schnittstelle zwischen dem Zellinnenraum und außenliegenden Bereichen. Um deren dynamische Struktur mittels Hochgeschwindigkeits-Rasterkraftmikroskopie (HS-AFM) untersuchen zu können, sind planare Modellsysteme nötig, die die natürliche Umgebung von Proteinen simulieren. Eine häufig genutzte Technik zur Probenpräparation ist es, Proteoliposome mit rekonstituierten Proteinen auf flachen, festen Oberflächen, wie zum Beispiel Glimmerplättchen, aufzuspreizen. Allerdings ist der Anwendungsbereich dieser Methode limitiert, da sie die Mobilität, die Konformation und auch die Funktionalität der in der aufliegenden Lipidschicht eingebetteten Proteine aufgrund von Wechselwirkungen zwischen hervorstehenden Protein-Domänen und der Oberfläche beeinflussen kann. Darüber hinaus wird der Transport von Substraten über die Membran durch den Platzmangel an der Unterseite behindert. Das ist insbesondere bei der Erforschung der in dieser Arbeit behandelten Translokations-Maschinerie ein Problem. Bei der post-translationalen Translokation arbeitet der Translokationskanal SecYEG mit dem Motorprotein SecA zusammen, um den Transport von großen Polypeptiden zu ermöglichen. Um diese Schwierigkeiten zu bewältigen, wurde eine Plattform entwickelt, die auf zweidimensionalen Streptavidin-Kristallen basiert. Das Protein-Gitter fungiert als löchriger Unterbau für periodisch aufliegende Membranen (PSM), die die rekonstituierten Transmembranproteine und biotinylierte Lipide enthalten. Streptavidin-Kristalle weisen kleine puffergefüllte Zwischenräume auf, sodass eine möglichst physiologische Umgebung mit Freiraum an der Unterseite geschaffen werden kann. Außerdem erlaubt es die PSM-Plattform die laterale Mobilität der eingebetteten Proteine einzustellen, und zwar über den Grad der chemischen Fixierung der Streptavidin-Kristalle. Das Potential dieser neuartigen und vielseitigen Methode wird an den Beispielen von SecYEG (Translokationskanal) und GlpF (Aquaglyceroporin) demonstriert. GlpF wurde mit sub-molekularer Auflösung abgebildet. Darüber hinaus konnte die Interaktion von SecYEG und SecA beobachtet werden.

Zusammenfassung (Englisch)

Lipid membranes are the physical boundaries of biological cells. Integral membrane proteins therein act as functional interfaces between the cell's interior and external environments. Planar model systems mimicking the proteins natural environment are needed to study their dynamic structure by high-speed atomic force microscopy (HSAFM). A common sample preparation technique is to spread proteoliposomes containing the reconstituted proteins of interest on at, hard substrates such as mica. However, the scope of this method is limited as it likely influences the mobility, the conformation as well as the functionality of the proteins embedded in these supported bilayers due to interactions between membrane protruding parts and the support. Moreover, transport of substrates across the membrane is impeded by the limited space on the support side. In particular, this is a problem when investigating the translocation machinery by HS-AFM, as in this thesis. In post-translational translocation, the translocation channel SecYEG interacts with the translocase motor SecA to enable the transport of large polypeptides. To overcome these issues, a platform based on self-assembling two-dimensional streptavidin crystals was developed. The protein lattice serves as 'holey' support for periodically suspended membranes (PSM) containing reconstituted transmembrane proteins and biotinylated lipids. Streptavidin crystals exhibit small buffer filled compartments, so that a near-physiological environment with free space on the support-side of the membrane can be established. Furthermore, the platform of periodically suspended membranes allows for tuning of the lateral mobility of the embedded proteins by varying the degree of chemical fixation of the streptavidin crystals. The capability of this novel and versatile method is demonstrated using SecYEG (translocation channel) and GlpF (aquaglyceroporin). Spatially confined GlpF was imaged at sub-molecular resolution and binding studies were performed on SecYEG and the associated motor protein SecA.