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Titelaufnahme

Titel
Characterization of the meiosis-specific zinc-finger protein PRDM9 / Author Mag.a Yasmin Striedner
AutorInnenStriedner, Yasmin
Beurteiler / BeurteilerinTiemann-Boege, Irene ; Baumgartner, Werner
Betreuer / BetreuerinTiemann-Boege, Irene
ErschienenLinz, April 2017
Umfang77 Blätter : Illustrationen
HochschulschriftUniversität Linz, Dissertation, 2017
Anmerkung
Zusammenfassung in deutscher Sprache
SpracheEnglisch
Bibl. ReferenzOeBB
DokumenttypDissertation
Schlagwörter (EN)PRDM9 / meiotic recombination / kinetics
Schlagwörter (GND)Zink-Finger-Proteine / Meiose / Rekombinantes Protein / Kinetik
URNurn:nbn:at:at-ubl:1-15238 Persistent Identifier (URN)
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Characterization of the meiosis-specific zinc-finger protein PRDM9 [3.55 mb]
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Zusammenfassung (Englisch)

PRDM9 (PR-domain containing protein 9) is a multi-domain protein, expressed in male and female germ cells at the beginning of meiosis. Using its long DNA-binding zinc finger domain, it controls the sites of the genetic exchange between maternal and paternal chromosomes, so called "recombination hotspots". This protein plays an important role for the protection of genome integrity, since it directs hotspots away from regions with gene expression.

This work presents first insights into the kinetics of the PRDM9-DNA interaction. Using state-of-the-art, biophysical techniques such as switchSENSE (Dynamic Biosensor GmbH, Munich) and gel-shift assays (EMSA), we observed that PRDM9 forms a highly stable complex with specific hotspot DNA lasting many hours. Such a long-lived interaction may be required for a successful translocation of the hotspot DNA to the “recombination initiation machinery” that targets the DNA for a double strand break necessary for the start of meiotic recombination. Furthermore, we analyzed the effect of single nucleotide polymorphisms in the DNA on the affinity of PRDM9.

Moreover, this thesis tested several cell systems for the expression of recombinant murine PRDM9Cst addressing their advantages and disadvantages. The large size of PRDM9 and the repetitive nature of its zinc finger domain poses difficulties to express this protein in multiple hosts, which is further complicated by its insolubility and degradation. Furthermore, several attempts of purifying PRDM9 led to a loss of function. Here we present an optimized protocol for PRDM9Cst lysate preparation, yielding a sufficient level of purity to be compatible with switchSENSE and EMSA, without the need for an affinity purification.

Zusammenfassung (Deutsch)

PRDM9 („PR-domain containing protein 9“) ist ein Protein mit verschiedenen funktionellen Domänen, das zu Beginn der Meiose in weiblichen und männlichen Keimzellen exprimiert wird. Mit seiner langen Zink-Finger Domäne bindet es an DNS und reguliert die Regionen im Genom wo ein Austausch zwischen mütterlichen und väterlichen Chromosomen, den so genannten „Hotspots“ der Rekombination, stattfindet. Dieses Protein dient dem Schutz des Genoms, indem es die meiotische Rekombination von Regionen abwendet, die für die Genexpression wichtig sind.

In dieser Arbeit werden erste Einblicke in die Bindungskinetik von PRDM9 an DNS präsentiert. Mit Hilfe von switchSENSE und Gel-Shift Experimenten (EMSA), haben wir herausgefunden, dass PRDM9 einen sehr stabilen Komplex mit spezifischer Hotspot-DNA bildet, der über einen Zeitraum von mehreren Stunden bestehen bleibt. Eine derart langlebige Interaktion könnte nötig sein, um die Hotspot-DNA mit der „Rekombinations-Initiations-Maschinerie“ in Kontakt zu bringen, welche die nächsten Schritte in der Rekombination einleitet. Außerdem wurde die Auswirkung von Einzelnukleotid-Polymorphismen in der DNA auf die Affinität von PRDM9 untersucht.

Des Weiteren wurden in dieser Dissertation verschiedenste Expressionssysteme zur Produktion der, in der Maus vorkommenden, rekombinanten PRDM9Cst Variante getestet und deren Vor- und Nachteile gegeneinander abgewogen. Die beträchtliche Größe von PRDM9 sowie der repetitive Aufbau der Zink Finger Domäne verursachten in mehreren Expressionssystemen beträchtliche Probleme. Eine weitere Herausforderung stellten die Fragmentierung von PRDM9 und dessen Unlöslichkeit dar. Sämtliche Versuche zur Aufreinigung von PRDM9 zeigten letztendlich einen Funktionsverlust des Proteins. In dieser Arbeit stellen wir ein optimiertes Protokoll zur Herstellung eines PRDM9Cst Lysats vor, das eine ausreichende Reinheit zum Zwecke der switchSENSE und EMSA Messungen aufweist, ohne der Notwendigkeit für eine weitere Affinitätsreinigung.

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