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Titelaufnahme

Titel
Synthesis and characterization of lanthanide complexes for Luminescence Resonance Energy Transfer (LRET) / submitted by Felix Faschinger
AutorInnenFaschinger, Felix
Beurteiler / BeurteilerinGruber, Hermann ; Fischer, Roland
Betreuer / BetreuerinGruber, Hermann
ErschienenLinz, 2017
Umfang102 Blätter : Illustrationen
HochschulschriftUniversität Linz, Dissertation, 2017
SpracheEnglisch
Bibl. ReferenzOeBB
DokumenttypDissertation
Schlagwörter (DE)Energie Transfer / Lanthanide / Europium / Lumineszenz
Schlagwörter (EN)energy transfer / lanthanides / europium / luminescence
Schlagwörter (GND)Energieübertragung / Lanthanoide / Europium / Lumineszenz
URNurn:nbn:at:at-ubl:1-19848 Persistent Identifier (URN)
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Synthesis and characterization of lanthanide complexes for Luminescence Resonance Energy Transfer (LRET) [5.75 mb]
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Zusammenfassung (Englisch)

Crystallography and NMR spectroscopy are ideally suited to resolve the 3D structures of biomolecules, but the material and time demand for each molecular structure is high. Fluorescence resonance energy transfer (FRET) provides less structural information but it is better suited for studying conformational changes and structure-function relationships by screening a large number of mutants or experimental conditions. Moreover, FRET allows for real time monitoring of conformational changes induced by specific ligands. Usually, FRET yields only a crude estimate of the donor-acceptor distance, due to the fact that the relative orientation of donor and acceptor are rarely known. Luminescence resonance energy transfer (LRET) is much better suited for distance measurements because the orientation factor (and thus the Förster distance) is known, and because energy transfer is measured by a change of the donor's lifetime, rather than of its signal intensity. ^In LRET-experiments the ideal donors are highly stable Eu- or Tbcomplexes, with a single lifetime that is not influenced by attaching the complex to a biomolecule. Several terpyridine-based Eu-complexes described in literature have promising properties concerning uniform lifetimes after protein labeling but all described complexes have rather long linkers which prevent accurate distance measurements.

In this thesis, new terpyridine-based Eucomplexes with very short linkers were synthesized and characterized. Complexes with two kinds of linkers designed for site-specific labeling were synthesized: (I) A maleimide-linker provided for coupling to thiols or cysteine mutants and (II) hydrazide-linker for coupling to aldehyde- or ketogroups or N-terminal serines/threonines after oxidation with periodate. ^The complexes showed a high quantum yield (32%), a single long lifetime (1.25 ms) which was not influenced by coupling to protein, very high stability in the presence of chelators like EDTA or EGTA, and no interaction with cofactors like ATP, ADP, AMP or GTP, as required for application to practical problems. LRET was measured in different model systems like DNA, coiled coil-forming peptides, and proteins. A variety of problems was encountered in these model studies: The synthetic DNA strands were only available with amino- or thiohexyl-linkers which obviated accurate distance measurement. Oligomerization or higher forms of aggregation led to quenching of one donor by more than one acceptor, and in some cases a direct interaction of donor and acceptor dye was observed. These findings revealed the difficulties in finding a well-defined calibration system for LRET. Fortunately the distance measurement by LRET was seen to properly work in SecA dimers. ^As described in the literature, the experiments with SecA showed that dimerization was dependent on the salt concentration in the buffer. Furthermore, LRET proved to be ideally suited to find out which surface areas in SecA-dimers are interacting with each other. This result is an example of scientific problems where LRET can give a correct answer, whereas crystallography cannot.

Zusammenfassung (Deutsch)

Strukturaufklärungsmethoden sind wichtig, um die Funktion von Biomolekülen und ihrer Wirkmechanismen aufzuklären bzw. zu verstehen. Kristallographie und NMR-Spektroskopie sind die Methoden der Wahl, um 3D-Strukturen hochauflösend zu bestimmen, jedoch ist der Zeit- und Materialaufwand beider Methoden sehr hoch. Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer (FRET) ist keine so hochauflösende Methode, doch ist es damit besser möglich, Konformationsänderungen und Struktur-Funktions-Zusammenhänge bei einer großen Zahl von Mutanten oder unter vielen verschiedenen experimentellen Bedingungen systematisch zu charakterisieren. Außerdem ist es mit FRET möglich, in Echtzeit durch Liganden induzierte Konformationsänderungen zu verfolgen. Leider ist es mit FRET schwierig, genaue Distanzen zu messen, und zwar deshalb, weil die relative Orientierung zwischen Donor und Akzeptor normalerweise nicht bestimmt werden kann. ^Lumineszenz-Resonanz-Energie-Transfer (LRET) ist wesentlich besser geeignet, um Distanzen zu bestimmen, einerseits weil der Orientierungsfaktor durch den isotrop lumineszierenden Donor und die (auf der langen Zeitskala der Lumineszenz) annähernd isotrope Rotationsdiffusion des Akzeptors bekannt ist (und somit der Försterradius genauer bestimmbar ist) und andererseits, weil der Energie-Transfer beim LRET im Gegensatz zum FRET nicht mittels Intensitätsmessungen sondern mittels Lebenszeitmessungen bestimmt wird, was viel genauer ist. Ideale LRET-Donoren sind stabile Eu- oder Tb-Komplexe mit einer einzigen langen Lumineszenz-Lebenszeit, welche sich nicht durch die Kopplung an Biomoleküle verändern darf. ^Es gibt in der Literatur einige vom Terpyridin abgeleitete Komplexe mit vielversprechenden Eigenschaften bezüglich einer uniformen Lebenszeit nach der Kopplung an Proteinen.

Jedoch haben all diese Komplexe entweder einen sehr langen Linker zur Kopplung an Biomoleküle, was genaue Distanz-Messungen verhindert, oder die Kopplung erfolgt nur unspezifisch an irgendwelche Lysinreste, was für eine Distanzmessung ungeeignet ist. Aus diesem Grund wurden in dieser Arbeit neue, auf Terpyridin basierende Eu-Komplexe hergestellt und charakterisiert, welche einen sehr kurzen Linker aufweisen. Es wurden Komplexe mit zwei Varianten von spezifischen Kopplungsgruppen synthetisiert: (I) Maleimid-Linker zur Kopplung an Thiole bzw. an Cystein-Mutanten und (II) Hydrazid-Linker zur Kopplung an Aldehyd- und KetoGruppen bzw. an N-terminale Serine/Threonine nach Oxidation mit Periodat. ^Die Komplexe wiesen eine hohe Lumineszenz-Quantenausbeute (32%) und nur eine einzige Lebenszeit (1.25 ms) auf, die durch Proteinkopplung nicht beeinflussbar war. Des Weiteren wiesen diese Komplexe eine hohe Stabilität in Gegenwart von Chelatoren wie EDTA oder EGTA und auch keine Interaktion mit Kofaktoren wie ATP, ADP, AMP oder GTP auf. Durch diese Eigenschaften können diese Komplexe unter praktisch allen erdenklichen biologisch relevanten Bedingungen eingesetzt werden. Praktische LRET-Messungen wurden an verschiedenen Modellsystemen wie DNA, Coiled-Coil-Peptiden und Proteinen durchgeführt. Dabei traten mehrere unerwartete Probleme auf: Die Amino- oder Thio-Hexyllinker von synthetischen DNA-Strängen waren zu lang, um doppelsträngige DNA als Testsystem verwenden zu können. ^Oligomerisierung oder höhere Aggregation führte dazu, dass ein Donor von mehreren Akzeptoren gequencht wurde, und auch die direkte Interaktion zwischen Donor und Akzeptorfarbstoff wurde beobachtet.

Distanzmessungen in SecA-Dimeren haben jedoch gezeigt, dass LRET-Messungen grundsätzlich gut funktionieren. Es konnte mittels LRET gezeigt werden, dass die Dimerisierung von SecA von der Salzkonzentration im Puffer abhängig ist, wie es schon in anderen Arbeiten festgestellt wurde. In weiterer Folge erwies sich LRET als die ideale Methode, um zu klären, welche Flächen in SecADimeren miteinander interagieren. Dies ist deshalb bemerkenswert, weil die Kristallographie keine korrekte Antwort auf diese Frage liefern kann.

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