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Bibliographic Metadata

Title
Determination of binding kinetics of PRDM9 via surface plasmon resonance / submitted by Nicole Zeppezauer
AuthorZeppezauer, Nicole
CensorTiemann-Boege, Irene
Thesis advisorSchwarz, Theresa
PublishedLinz, 2018
Descriptioniv, 76 Seiten : Illustrationen
Institutional NoteUniversität Linz, Masterarbeit, 2018
LanguageEnglish
Document typeMaster Thesis
URNurn:nbn:at:at-ubl:1-24795 Persistent Identifier (URN)
Restriction-Information
 The work is publicly available
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Determination of binding kinetics of PRDM9 via surface plasmon resonance [2.77 mb]
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Abstract (German)

Das Protein PRDM9 oder „PR-domain containing protein 9“, spielt eine wesentliche Rolle in der Lokalisierung der Meiotischen Rekombination, welche das genetische Material neugestaltet und die genetische Vielfalt einer Population erhöht. Jedoch ist nicht viel darüber bekannt wie dieses Protein an die DNS Sequenz bindet und zwar bezogen auf Mengenverhältnisse. Diese Masterarbeit befasst sich mit Bindungsstudien, genauer gesagt, der Affinität und Kinetik des von der Maus-abstammenden Proteins PRDM9 zu ihrer spezifischen DNS Sequenzen. Viele Schritte zur Etablierung bis zur finalen Datengenerierung waren dafür notwendig. Als erstes die Proteinexpression und Aufreinigung um ein funktionelles und lösliches Protein zu erhalten. Zweitens, Optimierung der DNA Synthese via PCR zur DNS Vervielfachung sowie Modifikation. Drittens, benötigte es Funktionalitätstests zur Überprüfung der Protein-DNS-Bindung durch Westernblot und EMSA. Viertens, ein optimierter erfolgreicher SPR Chip Aufbau und schließlich das erste Ansammeln von Bindungsstudiendaten. Die Resultate dieser Masterarbeit reflektieren ein vorausgegangenes Paper (Striedner, Schwarz et al. 2017) indem aufgezeigt wurde, dass es sich um eine sehr stabile und langlebige Form der Bindung handelt, nicht zuletzt, weil die Dissoziation mehrere Stunden andauert. In dieser Masterarbeit ist tendenziell eine sehr schnelle Assoziation, gefolgt von einer sehr langsamen Dissoziation beobachtet worden bei zusätzlichen DNS Sequenzen sowie anderen PRDM9 Allelen/Varianten.

Abstract (English)

The protein PRDM9 or PR-domain containing protein 9, plays a major role in localizing meiotic recombination, which reshuffles the genetic material and increases the genetic diversity in populations. However, not much is known about this proteins binding behaviour to the DNA sequence in quantitative terms. This master thesis encompasses the study of the binding affinity and kinetics of murine PRDM9 to its specific target DNA sequences via SPR measurements. To establish and obtain this new data set, multiple preparation steps were done. First, starting with protein expression and purification to obtain a functional and soluble protein. Second, the optimization of DNA synthesis using PCR for DNA amplification and DNA modification. Third, functionality tests of the protein-DNA interaction via Westernblot and EMSA. Forth, the SPR chip setup was optimized for this particular system, and finally, a series of different SPR measurements were performed to gather kinetic binding information on PRDM9-DNA interactions. The results of this master thesis approach a previous paper (Striedner, Schwarz et al. 2017), which demonstrated, that PRDM9 forms a highly stable complex with its binding target with dissociation times of several hours. In this master thesis, a very fast association was observed followed by a very slow dissociation for additional DNA sequences, as well as, other PRDM9 alleles/variants.

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