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Titelaufnahme

Titel
Total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM) guided analysis of receptor tyrosine kinase (RTK) signaling / eingereicht von: Peter Lanzerstorfer
VerfasserLanzerstorfer, Peter
Begutachter / BegutachterinRomanin, Christoph ; Gruber, Hermann
Erschienen2015
UmfangIII, 85 Bl. : Ill., graph. Darst.
HochschulschriftLinz, Univ., Diss., 2015
Anmerkung
Zsfassung in dt. Sprache
SpracheEnglisch
Bibl. ReferenzOeBB
DokumenttypDissertation
Schlagwörter (DE)TIRFM / Tyrosinkinasenrezeptoren / Micropatterning / EGFR / IR / IGF-IR / GLUT4
Schlagwörter (EN)TIRFM / Tyrosine kinase receptors / Micropatterning / EGFR / IR / IGF-IR / GLUT4
Schlagwörter (GND)Rezeptor-Tyrosinkinasen / TIRF
URNurn:nbn:at:at-ubl:1-646 Persistent Identifier (URN)
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Total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM) guided analysis of receptor tyrosine kinase (RTK) signaling [5.46 mb]
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Zusammenfassung (Englisch)

Tyrosine kinase receptors (RTKs) are transmembrane proteins which are activated following binding with peptide growth factors or hormones and play key roles in processes such as cellular growth, metabolism, motility and differentiation. Recent evidence suggests that these receptors are involved in the pathogenesis and progression of a variety of cancers. In addition, dysfunction in IR and IGF-IR signaling is strongly linked to obesity and type 2 diabetes mellitus. Due to the fact that these receptors have major influences on human health, they were intensively investigated and became major drug targets for the above mentioned diseases. Aim of this thesis was to set up a novel and workable live cell analysis platform based on micropatterned surfaces for studying the influence of tyrosine kinase receptor signaling modulating substances on the one hand, and on the other hand a screening platform for the identification and characterization of insulin mimetic substances. The respective chapters were published in different scientific journals.

(1) Quantification and Kinetic Analysis of Grb2-EGFR Interaction on Micro-Patterned Surfaces for the Characterization of EGFR-Modulating Substances. PLOS ONE (2014).

In this chapter we report on a technique which combines micro-patterned surfaces and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy (-patterning assay) for the quantitative analysis of EGFR activity.

Here we quantified the interaction of the key signal transmitting protein Grb2 (growth factor receptor-bound protein 2) with the EGFR in a live cell context. It was possible to demonstrate an EGF dependent recruitment of Grb2 to the EGFR, which was significantly inhibited in the presence of clinically tested EGFR inhibitors. Importantly, in addition to its potential use as a screening tool, our experimental setup offers the possibility to provide insight into the molecular mechanisms of bait-prey interaction. Application of bleaching experiments enabled calculation of the Grb2 exchange rate, which significantly changed upon stimulation or the presence of EGFR activity inhibiting drugs.

(2) Analysis of insulin receptor substrate (IRS) signaling dynamics on micro- structured surfaces. FEBS Journal (2015).

Here we provide additional insight into IR/IGF-IR downstream signaling via insulin receptor substrate (IRS) proteins. Interaction of IR/IGF-IR with IRS proteins is an initial key event for downstream signaling and bioactivities. Despite the structural similarities, increasing evidences show that IRS family proteins have non-redundant functions. Although the specificity of insulin/IGF signaling and biological responses in part reflects which IRS proteins are dominantly phosphorylated by the receptors, the precise properties of respective IRS interaction with the receptors remain elusive. Again we used the -patterning assay for the quantitative analysis of the interaction between IRS proteins and IR/IGF-IR in living cells. Our experimental setup enabled the measurement of equilibrium associations and interaction dynamics of these molecules with high specificity. We revealed that several domains of IRS including pleckstrin homology and phosphotyrosine binding domains critically determine the turnover rate of the receptors. Furthermore, we found significant differences among IRS proteins in the strength and kinetic stability of the interaction with the receptors, suggesting that these interaction properties could account for the diverse IRS functions. In addition, our analyses using fluorescent recovery after photobleaching revealed that kinases such as c-Jun N-terminal kinase and IkB kinase beta, which phosphorylate serine/threonine residues of IRS and contribute to insulin resistance, altered the interaction kinetics of IRS with insulin receptor. (3) Identification of Novel Insulin Mimetic Drugs by Quantitative Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) Microscopy (2014).

Finally, we used quantitative TIRFM to investigate the glucose transporter 4 (GLUT4) translocation modulatory properties of selected phytochemicals (chapter 5). For this purpose, TIRFM was applied to quantify GLUT4 translocation in highly insulin-sensitive CHO-K1 cells expressing a GLUT4-myc-GFP fusion protein. Using our approach, we demonstrated the influence of selected phytamines on GLUT4 translocation and identified novel potential insulin mimetics. An increase in the TIRF signal was found to correlate with an elevated glucose uptake.

Variations in the expression level of the human insulin receptor (hInsR) showed that the insulin mimetics identified stimulate GLUT4 translocation by a mechanism that is independent of the presence of the hInsR. Taken together, the results indicate that TIRF microscopy is an excellent tool for the quantification of GLUT4 translocation and for identifying insulin mimetic drugs.

Zusammenfassung (Deutsch)

Die Familie der Tyrosin-Kinasen-Rezeptoren (TKR) beinhaltet essenzielle Membranprotein die für die Zell-Zell-Kommunikation von wesentlicher Bedeutung sind. Hierunter befinden sich auch der Epidermale Wachstumsfaktor Rezeptor (EGFR), der Insulin Rezeptor (IR) und der Insulin-ähnliche Wachstumsfaktor Rezeptor (IGF-IR). Diese Rezeptoren werden durch Wachstumsfaktoren (Insulin, EGF, IGF,...) aktiviert und haben eine Schlüsselrolle bei der Regulierung von Zellprozessen wie Zellwachstum, Metabolismus und Zelldifferenzierung. Neueste Studien belegen, dass diese Rezeptoren aufgrund ihrer zellulären Funktion bei der Entstehung einer Vielzahl von unterschiedlichen Krebsarten eine entscheidende Rolle spielen. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass Fehlfunktionen des IR und IGF-IR mit Störungen im Fett- (Fettleibigkeit) und Kohlenhydratstoffwechsel (Diabetes) einhergehen. Durch diese klaren Zusammenhänge sind diese Rezeptoren in den letzten Jahren zu Hauptangriffspunkten bei der Behandlung der bereits erwähnten Krankheiten geworden.

Um die Wirksamkeit von Rezeptor-modulierenden Substanzen testen und charakterisieren zu können wurde eine Vielzahl an chemischen, biologischen und biophysikalischen Testmethoden entwickelt. Die immer komplexer werdende Welt der Wirkstoffsuche- und Analyse macht es jedoch notwendig, einfache und kostengünstige Analysenplattformen zu entwickeln. Ziel dieser Studie war einerseits die Etablierung einer in-vitro Analysenmethode basierend auf einem -Biochip zur Erforschung von TKR-modulierenden Substanzen, andererseits die Setup Entwicklung für quantitative Totale-Interne-Reflektions-Fluoreszenz-Mikroskopie (TIRFM) zum Screening von Insulin-mimetischen Substanzen. Die in der Dissertation vorliegenden Arbeiten wurden als wissenschaftliche Publikationen in Fachjournalen veröffentlicht.

(1) Quantification and Kinetic Analysis of Grb2-EGFR Interaction on Micro-Patterned Surfaces for the Characterization of EGFR-Modulating Substances. PLOS ONE (2014) In dieser Arbeit beschreiben wir die Verwendung von -Biochips in Kombination mit TIRFM zur quantitativen Analyse der in-vitro EGFR Aktivität durch Charakterisierung der Interaktion mit dem Schlüsselprotein Grb2 (Growth factor binding protein 2). Grb2 ist der erste intrazelluläre Signaltransmitter nach EGFR Stimulation und es konnte gezeigt werden, dass dieses Protein in einem Agonist-abhängigen Zusammenhang zum Rezeptor rekrutiert wird. Diese Rekrutierung wurde signifikant inhibiert durch die Gegenwart von klinischen EGFR Inhibitoren. Neben der möglichen Anwendung als Screeningtool ermöglicht dieses Setup auch die Erforschung molekularer Signalisierungsmechanismen, wie mittels FRAP (Fluorescence recovery after photobleaching) Experimenten gezeigt wurde.

(2) Analysis of insulin receptor substrate (IRS) signaling dynamics on micro- structured surfaces. FEBS Journal (2015) Mit Hilfe des -patterning Assays wurde in dieser Publikation die Interaktion zwischen IR/IGF-IR und dem Downstreammolekül IRS (Insulin receptor substrate) charakterisiert. Unterschiedliche IRS-Proteine (IRS1-4) haben schlussendlich auch unterschiedlichste biologische Outputs zur Folge, wobei die genauen Mechanismen noch nicht bekannt sind. Hier zeigen wir eine quantitative Analyse der Bindungskinetiken und Turnoverraten zwischen IR/IGF-IR und IRS und berichten über den Einfluss wichtiger Bindungs- und Phosphorylierungsdomainen in diesem Zusammenhang. Es konnte ein signifikanter Unterschied zwischen den IRS-Proteinen hinsichtlich Interaktionsstärke und Bindungsstabilität am Rezeptor festgestellt werden. Des Weiteren konnte die Rolle spezifischer Phosphorylierungsmuster an IRS-Proteinen (Serin/Threonin) bezüglich subzellulärer Lokalisierung weiter vorangetrieben werden.

(3) Identification of Novel Insulin Mimetic Drugs by Quantitative Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) Microscopy (2014) Die dritte Publikation behandelt die Etablierung eines quantitativen TIRM-Setups zur Erforschung von sogenannten Phytaminen welche modulierende Wirkungen auf den Glukose Transporter 4 (GLUT4) besitzen.

Zu diesem Zweck wurden insulin-sensitive CHO-K1 Zellen mit überexprimiertem GLUT4-GFP verwendet. Durch diese präzise TIRM-Methode konnte der Einfluss unterschiedlicher Phytamine auf die GLUT4-Translokation gezeigt bzw. neuartige insulin-mimetische Substanzen identifiziert werden.