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Titelaufnahme

Titel
Inter- and intramolecular interactions of VWF studied by AFM / eingereicht von: Sandra Posch
VerfasserPosch, Sandra
Begutachter / BegutachterinHinterdorfer, Peter ; Schütz, Gerhard
ErschienenLinz, September 2015
UmfangVIII, 110 Seiten : Illustrationen
HochschulschriftUniversität Linz, Univ., Dissertation, 2015
Anmerkung
Zusammenfassung in deutscher Sprache
SpracheEnglisch
Bibl. ReferenzOeBB
DokumenttypDissertation
Schlagwörter (DE)Rasterkraftmikroskop / Einzelmolekül-Kraftspektroskopie / von Willebrand Faktor / Kräfte / Einzelmolekül-Wechselwirkungen
Schlagwörter (EN)atomic force microscope / single molecule force spectroscopy / von Willebrand factor / forces / single molecule interactions
Schlagwörter (GND)Willebrand-Faktor / Kollagen / Einzelmolekülspektroskopie / Mutation / Blutstillung
URNurn:nbn:at:at-ubl:1-5069 Persistent Identifier (URN)
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Inter- and intramolecular interactions of VWF studied by AFM [8.14 mb]
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Zusammenfassung (Deutsch)

The von Willebrand factor (VWF) is a huge multimeric protein that plays a key role in hemostasis. It triggers platelet adhesion in areas of vascular damage by binding to exposed sub-endothelial collagen and thus causes wound closure. Sites for binding to collagen, an initial step of hemostasis, are located in domains A1 and A3 of VWF. Collagen III is believed to interact with the A3-domain, and collagen VI with the A1-domain. The forces and the dynamics of these interactions were investigated with single molecule force spectroscopy (SMFS), using AFM tips functionalized with VWF and substrates containing a dense layer of collagen. We also investigated three mutations in the A3-domain of the VWF A1-A2-A3 construct (S1731T, Q1734H and H1786R). Interactions between collagen type III or VI and the S1731T mutant showed no significant difference in stability when compared to the wild type construct. The A3-domain mutations Q1734H and H1786R formed a slightly more stable complex with collagen III, probably due to additional hydrogen bonds.

The same mutants on collagen VI resulted in a drastic increase in bond stability. Thus VWF domain A1 might compensate for mutations in domain A3 which could explain the inconspicuous bleeding tendency found in patients carrying these VWF A3 domain mutations.

VWF domain A1 is also responsible for mediating platelet adhesion under flow through the platelet glycoprotein Ib[alpha] (GPIb[alpha]). The adjacent domain A2 is unfolded under shear upon which it exposes a proteolytic site that is cleaved by the metalloprotease ADAMTS13 to prevent thrombosis. In the resting state, i.e. under low shear-stress conditions, VWF is incapable of binding platelets. This behavior has been associated with a shielding of the GPIb[alpha] binding site in domain A1 by domain A2. Nevertheless, the exact shielding mechanism has not been clarified yet. We thus probed the interaction strength between the A1 and A2 domains and the unfolding behavior of A2 using SMFS.

Domain A2 remained largely folded during the dissociation process from A1, keeping the VWF protected against cleavage and degradation.

In summary, the intermolecular binding between VWF and collagen and intramolecular VWF domain association processes were characterized to elucidate key initial steps in hemostasis.

Zusammenfassung (Englisch)

Der VWF ist ein großes multimeres Protein, welches eine essentielle Rolle in der Hämostase spielt. Beim Wundverschluss agiert der VWF im Bereich von verletzen Gefäßen als Verbindung zwischen den freigelegten Kollagenschichten und den zirkulierenden Blutplättchen.

Kollagenbindungsstellen für eine initiale Interaktion, befinden sich in den Domänen A1 und A3 des VWFs. Die VWF-Domänen A1 und A3 sind essentiell für die Interaktion mit Kollagen Typ VI, beziehungsweise III.

Die Kräfte und Dynamiken dieser Wechselwirkungen wurden mittels Einzelmolekül-Kraftspektroskopie (SMFS) untersucht. Dabei wurden die AFM-Spitzen mit VWF Molekülen funktionalisiert und die Probenoberflächen mit einer dichten Kollagenschicht beschichtet. Es wurden auch drei Mutationen (S1731T, Q1734H und H1786R), welche sich in der A3 Domäne des A1-A2-A3 Konstrukts befinden, untersucht. Wechselwirkungen zwischen Kollagen Typ III und VI zeigten, im Vergleich zum Wildtyp (wt), keinen signifikanten Unterschied in der Bindungsstabilität. Die A3 Mutationen Q1734H und H1786R formten, wahrscheinlich auf Grund von zusätzlichen Wasserstoffbrückenbindungen, einen leicht stabileren Komplex mit Kollagen III. Die gleichen Mutationen zeigten jedoch eine drastisch erhöhte Bindungsstabilität, gemessen mit Kollagen Typ VI. Demnach wäre es denkbar, dass die VWF A1 Domäne Mutationen in der Domäne A3 kompensieren kann. Dies wäre auch eine Erklärung für das unauffällige Blutungsverhalten von Patienten, die diese Mutationen in sich tragen. Die Domäne A1 ist ebenso für die Blutplättchen-Adhäsion unter Fluss, mittels Glykoprotein Ib[alpha] (GPIb[alpha]), verantwortlich. Die benachbarte Domäne A2 wird unter Scherung entfaltet, wodurch eine proteolytische Stelle freigelegt wird. Die Metalloprotease ADAMTS 13 kann dann an dieser Stelle angreifen und somit durch Spaltung des VWFs Thrombosen verhindern. Im Ruhezustand, also unter geringer Scherrspannung, kann der VWF keine Blutplättchen binden. Dieses Verhalten wurde einer möglichen Abschirmung der GPIb[alpha]-Bindungsstelle in der A1 Domäne durch Domäne A2 zugeordnet.

Nichtsdestotrotz ist der exakte Mechanismus der Abschirmung noch nicht bekannt. Aus diesem Grund untersuchten wir die Interaktionskräfte zwischen den VWF Domänen A1 und A2, sowie das Entfaltungsverhalten der A2 Domäne mittels SMFS. Die A2 Domäne bleibt bei der Loslösung von Domäne A1 weitgehend gefalten. Das verhindert eine vorzeitige Zersetzung und einen damit verbundenen Abtransport.

Zusammenfassend kann man sagen, dass die hier vorliegende Arbeit die intermolekularen Bindungen zwischen dem VWF und Kollagen, sowie die intramolekularen Domänenwechselwirkungen charakterisiert, um den wichtigen ersten Schritt der Hämostase aufzuklären.